Μεταξύ των κρατιδίων της Ηπείρου και της Νίκαιας αναπτύχθηκε εξ΄αρχής εμπόλεμος ανταγωνισμός για τη διεκδίκηση της παλινόρθωσης της αυτοκρατορίας. Καθοριστική ήταν το 1259 η μάχη της Πελαγονίας, κατά την οποία ο Μιχαήλ Β΄ (1231-1267/8) της Ηπείρου ηττήθηκε από το στρατό της Νίκαιας. Στη συνέχεια καταλήφθηκε η Άρτα, ενώ τα Γιάννινα πολιορκήθηκαν ανεπιτυχώς. Το 1261 την Κωνσταντινούπολη κατέκτησε ο στρατός της Νίκαιας. Το κράτος της Ηπείρου διατήρησε τον αυτόνομο χαρακτήρα του και η σχέση του με την απελευθερωμένη Κωνσταντινούπολη πέρασε άλλοτε φάσεις προσέγγισης και άλλοτε αντιπαλότητας .

Μετά από το θάνατο του Μιχαήλ Β΄, η επικράτειά του διαμοιράσθηκε ανάμεσα στους γιούς του. Η Ήπειρος περιήλθε στον Νικηφόρο Α΄(΄1267-1296). Ο γάμος του με την Άννα Παλαιολογίνα, ανιψιά του βυζαντινού αυτοκράτορα Μιχαήλ Η΄, συνδέεται με ένα είδος κηδεμονίας της Κωνσταντινούπολης, που σύντομα μεταστράφηκε λόγω της αντιπαράθεσης για την ένωση των εκκλησιών (1276-1277). Κατά μία άποψη, τα Γιάννινα πιθανόν προσχώρησαν γύρω στα 1284 στη Βυζαντινή αυτοκρατορία, προκειμένου να εξασφαλίσουν καθεστώς αυτονομίας, αλλά σύντομα προσέγγισαν εκ νέου την Άρτα. Το 1290 ή 1292 ο στρατός του βυζαντινού αυτοκράτορα πολιόρκησε ανεπιτυχώς την καλά οχυρωμένη πόλη των Ιωαννίνων.

Λήγοντος του 13ου αιώνα η πόλη των Ιωαννίνων αποτελεί σημαντικό κέντρο της περιοχής με ισχυρό τείχος, ναούς και αρχοντικά. Την εποχή αυτή το νησί γίνεται σπουδαίο μοναστικό κέντρο. Από τις γνωστές βυζαντινές οικογένειες των Φιλανθρωπινών και των Στρατηγόπουλων ιδρύονται οι περιώνυμες μονές αφιερωμένες στον Άγιο Νικόλαο. Η σημασία της πόλης είναι φανερή από το γεγονός ότι, όταν το 1304 ο Κάρολος ΙΙ d΄Anjou της Νεαπολέως εκστράτευσε κατά της Άρτας, η Άννα κατέφυγε στα Γιάννινα, που ιστορικές πηγές της εποχής χαρακτηρίζουν το Κάστρο τους ως απόρθητο.

Ο τελευταίος Κομνηνοδούκας δεσπότης, Θωμάς, γιος του Νικηφόρου, δολοφονήθηκε το 1318 από τον ανιψιό του Νικόλαο Ορσίνι, κόμη της Κεφαλληνίας. Οι Γιαννιώτες αρνήθηκαν να αναγνωρίσουν το νέο δυνάστη και έτσι η πόλη τους ζήτησε την υπαγωγή της στο βυζαντινό αυτοκράτορα. Τα Γιάννινα παρέλαβε ο Συργιάννης Παλαιολόγος, διοικητής των δυτικών βυζαντινών κτήσεων. Ως ανταπόδοση η επισκοπή της πόλης προήχθη σε Μητρόπολη (1318) και διατήρησε την περιουσία της, ενώ στους κατοίκους παραχωρήθηκαν πλήθος προνομίων. Δύο χρυσόβουλα - αυτοκρατορικά διατάγματα των ετών 1319 και 1321 του αυτοκράτορα Ανδρονίκου Β΄ Παλαιολόγου εξασφάλιζαν τη μη παραχώρηση των Ιωαννίνων και των γύρω κάστρων στους Φράγκους και περιλάμβαναν φορολογικά προνόμια και απαλλαγές για τους κατοίκους της πόλης. Οι «καστρινοί Ιωαννινιώται», εκτός από όσους ανήκαν σε στρατιωτικά σώματα, δεν ήταν υποχρεωμένοι να προσφέρουν στρατιωτικές υπηρεσίες έξω από την πόλη τους. Ωστόσο ο διοικητής της πόλης διοριζόταν από τον αυτοκράτορα . Την εποχή αυτή τα Γιάννινα γνώριζαν ιδιαίτερη ακμή : «το περί την Ήπειρον άστυ… μεμέστωται οικητόρων, ακμάζει δε πλούτω ..», όπως αναφέρεται στο πρώτο χρυσόβουλο. Κατά τον ιστορικό Λ.Βρανούση στα κείμενα αυτά περιγράφεται ένα είδος πρώιμης αστικής κοινωνίας με αριστοκρατία, που ξέρει να αυτοκυβερνηθεί κατ’ αναλογία με τα ακμαία κρατίδια των πόλεων της Ιταλίας.

Ο Νικόλαος Ορσίνι νυμφεύθηκε τη σύζυγο του Θωμά, Άννα και έλαβε τον τίτλο του δεσπότη από την Κωνσταντινούπολη με τη δέσμευση να μην επιτεθεί στα Γιάννινα. Εκείνος όμως εκμεταλλευόμενος τον εμφύλιο μεταξύ του Ανδρονίκου Β΄ και Γ΄, που ξέσπασε εν τω μεταξύ στη βυζαντινή πρωτεύουσα, πολιόρκησε την πόλη ανεπιτυχώς. Το 1323 κατά την ένοπλη σύγκρουση με τον αδελφό του Ιωάννη, ο Νικόλαος σκοτώθηκε. Ο Ιωάννης έπεισε τους Γιαννιώτες να τον αποδεχτούν κερδίζοντας τη συμπάθειά τους με ανανέωση των προνομίων (1330). Το 1337 ή νωρίτερα δολοφονήθηκε από τη βυζαντινή σύζυγό του και οι Γιαννιώτες ορκίστηκαν σε εκείνη και το γιο της Νικηφόρο πίστη. Στο μεταξύ, το 1338, ο αυτοκράτορας Ανδρόνικος Γ΄ ήλθε στην Ήπειρο προκειμένου να ενισχύσει τη βυζαντινή κυριαρχία και κυρίως να αντιμετωπίσει τις αλβανικές εισβολές . Κατά τον εμφύλιο μεταξύ του Ιωάννη Ε΄ Παλαιολόγου και του Ιωάννη Στ΄ Καντακουζηνού(1341-7), όταν ο δεύτερος έγινε κύριος της Ηπείρου και της Θεσσαλίας, επέτρεψε στους Σέρβους να επιβληθούν. Τα Γιάννινα ίσως είχαν ήδη καταληφθεί από το 1346, ενώ η κατάκτηση της Ηπείρου και της Θεσσαλίας ολοκληρώθηκε το 1348 και ανατέθηκε στον ετεροθαλή αδελφό του Στέφανου Δουσάν, Συμεών Ούρεση. Στα 1366 οι Γιαννιώτες με σκοπό την εξασφάλιση προστασίας από τις επιθέσεις των Αλβανών ζήτησαν από τον Συμεών να τους υποδείξει ηγεμόνα. Εκείνος τους έστειλε το γαμπρό του, Θωμά Πρελιούμποβιτς (1367-1384). Η αποδοχή του από τους κατοίκους της πόλης δεν ήταν ομόθυμη. Ο Θωμάς έλαβε σκληρά μέτρα για τους άρχοντες και την τοπική εκκλησία, έδιωξε το μητροπολίτη και αφαίρεσε εκκλησιαστικά κτήματα.

Επέβαλε φόρους και στρατιωτικά βάρη, τα οποία ωστόσο ήταν απαραίτητα για την αντιμετώπιση των πιεστικών επιθέσεων των Αλβανών, οι οποίοι είχαν επικρατήσει στην Άρτα και την Αιτωλοακαρνανία. Τη δεκαετία του 1370 τα Γιάννινα πολιορκήθηκαν επανειλημμένα από Αλβανούς και ερημώθηκε η γύρω περιοχή. Στις πολεμικές επιχειρήσεις του ο Θωμάς συνεργάστηκε με Τούρκους με αποτέλεσμα τουρκικές εγκαταστάσεις στην Ήπειρο. Το 1382 ζήτησε και έλαβε τον τίτλο του δεσπότη από τον αυτοκράτορα Μανουήλ Β΄, ενώ δύο χρόνια αργότερα δολοφονήθηκε από σωματοφύλακά του. Ο μαρμάρινος τάφος του βρέθηκε το 1795 κατά την θεμελίωση του σεραγιού του Αλή Πασά.

Ο Θωμάς έκανε εκτεταμένες επεμβάσεις στα τείχη. Όπως αναφέρεται σε ιστορικές πηγές της περιόδου «προς φύλαξιν του έκτισε και κάστρον με πύργους εύμορφον .. και έκτισε παλάτια μεγάλα και εύμορφα». Πιθανότατα η ενίσχυση της οχύρωσης έγινε για να αντιμετωπίσει τους Αλβανούς ίσως πριν την επίθεση του 1379. Σ΄ αυτόν οφείλεται η κατασκευή του οχυρού πύργου δεξιά της κυρίας εισόδου του κάστρου, καθώς και της πύλης της βορειανατολικής ακρόπολης, η οποία εξυπηρετούσε την ενίσχυση της κατοικίας του δεσπότη . Αρκετά και γενναιόδωρα ήταν τα αφιερώματα του Θωμά σε μονές (Μεγάλο Μετέωρο, Μεγίστη Λαύρα, Γαβαλίωτισσα Βοδενών ). Μετά τη δολοφονία του τα Γιάννινα κυβέρνησαν Φράγκοι με τη σύμφωνη γνώμη των αρχόντων. Η χήρα του Θωμά, Μαρία Αγγελίνα Δούκαινα Παλαιολογίνα, παντρεύτηκε τον πρίγκιπα Ιζαού Μπουαντελμόντι του οίκου Ατζαγιόλι της Φλωρεντίας, άρχοντα της Κεφαλληνίας. Ο Ιζαού χρίσθηκε το 1386 δεσπότης από το βυζαντινό αυτοκράτορα και επέστρεψε την περιουσία της εκκλησίας. Την εποχή αυτή οι επιδρομές των Αλβανών συνεχίζονταν στα περίχωρα των Ιωαννίνων, με αποτέλεσμα το 1388-9 ο Ιζαού να δηλώσει υποτέλεια στο σουλτάνο για να αντιμετωπίσει την αλβανική απειλή .Το γεγονός αυτό σε κάποιες από τις ιστορικές πηγές θεωρείται ως η πρώτη τουρκική κατάκτηση των Ιωαννίνων.

Ο Ιζαού πέθανε το 1411 και τον διαδέχθηκε μετά από πρόσκληση της τοπικής αριστοκρατίας ο Κάρολος Α΄ Τόκκος, δούκας της Κεφαλληνίας, ο οποίος όπως και προκάτοχοι του, πήρε το 1415 τον τίτλο του δεσπότη από το βυζαντινό αυτοκράτορα. Το 1416 ο Κάρολος κατέλαβε την Άρτα και κυβέρνησε έως το 1429. Το «Χρονικό των Τόκκο» γραμμένο στα 1429 είναι ένα έμμετρο έπος, που αναφέρεται στις ηρωικές πράξεις του Καρόλου και του αδελφού του Λεονάρδο. Ο ανιψιός του Καρόλου Α΄, Κάρολος Β΄ και οι νόθοι γιοι του, ελάχιστα πρόλαβαν να κυβερνήσουν, καθώς στα 1430 η πόλη υπέκυψε στους Τούρκους.

Σύμφωνα με τους περισσότερους ερευνητές η βυζαντινή φυσιογνωμία της πόλης διατηρήθηκε κατά την εποχή του σέρβου και των ιταλών ηγεμόνων της, καθώς εκείνοι αναλάμβαναν τα καθήκοντα τους μετά από διαπραγματεύσεις με την τοπική αριστοκρατία και λάμβαναν τον τίτλο του δεσπότη από το βυζαντινό αυτοκράτορα. Επίσης η πόλη δεν γνώρισε την Αλβανική κατοχή, όπως αναφέρει το Χρονικό των Ιωαννίνων: «.. μόνη δε η των Ιωαννίνων πόλις μη υποκύψασα τη των Αλβανιτών επικράτεια » . Η καστρινή αριστοκρατία έχει στην ιδιοκτησία της χωριά και γαίες. Αναπτυγμένη είναι η βιοτεχνία και το εμπόριο. Τα Χρονικά των Ιωαννίνων και των Τόκκων, που γράφτηκαν στις αρχές του 15ου αιώνα δίνουν σημαντικές πληροφορίες, που αφορούν στην ιστορία, την τοπογραφία και την κοινωνική διαστρωμάτωση της πόλης. Το κάστρο της πόλης έχει μεγάλη φήμη την εποχή αυτή και χαρακτηρίζεται στις πηγές: « λαμπρόν, βασιλικόν και ευγενές ». Σύμφωνα με χειρόγραφο του 1819, αντίγραφο του λεγόμενου «Κουβαρά», μιας χρονογραφίας του 14ου-15ου αιώνα, υπήρχαν στην πόλη πέντε μονές και εικοσιπέντε ναοί, από τους οποίους οι δεκαοκτώ ήταν μέσα στο κάστρο. Αναφέρεται ότι στη θέση του σεραγιού του Αλή Πασά υπήρχε συγκρότημα του ναού του Παντοκράτορα, ενώ στην άκρη του σεραγιού μνημονεύεται ο σωζόμενος έως το 1779 ναός της Μητρόπολης, ίσως στη θέση του Φετιχιέ. Άρα κατά την υστεροβυζαντινή περίοδο η νοτιοανατολική ακρόπολη, η παλαιά ακρόπολη του Βοημούνδου, καταλαμβανόταν από εκκλησιαστικά ιδρύματα ίσως και επισκοπείο , καθώς και οικίες προς το μέρος της σημερινής πόλης .

Ασάφεια υπάρχει ως προς οικιστική κατάσταση εκτός του κάστρου. Πολλοί μελετητές πιστεύουν, ότι και κατά τη μεσαιωνική περίοδο (ήδη ίσως από το 12ο αιώνα) υπήρχαν συνοικίες έξω από το τείχος . Κατά μία άλλη άποψη η μεγάλη έκταση, που περιλαμβανόταν εντός των τειχών, ήταν επαρκής για τον πληθυσμό της πόλης και έτσι εκτός των τειχών υπήρχαν μόνο υποτυπώδεις εμπορικές εγκαταστάσεις, σύμφωνα με τη μεσαιωνική συνήθεια των παζαριών στις πύλες των πόλεων, πρακτική, που καθιερώθηκε στην πόλη επί Τουρκοκρατίας. Εξάλλου και στις υστεροβυζαντινές πηγές δεν γίνεται αναφορά για μπούρκο, δηλαδή εκτος τειχών οικισμό ή εμπόριον-μποριό, αλλά αναφέρονται μόνον αμπέλια. Από τις μονές εκτός των τειχών μνημονεύονται του Αρχιμανδρειού, της Αγίας Παρασκευής , του Αγίου Αθανασίου κ.α .

Μετά 1430 η πόλη αναπτύσσεται εκτός των τειχών επί των οδικών αξόνων προς την Άρτα, την Παραμυθιά καθώς και προς το Ιόνιο και την Αλβανία. Δημιουργούνται μουσουλμανικές συνοικίες, όπως το Τουρκοπάλουκο (στρατόπεδο των Τούρκων ίσως κοντά στον Άγιο Νικόλαο της Αγοράς) και αργότερα στην Καλούτσιανη. Γύρω από το Κάστρο αναπτύσσονται οι εβραϊκές συνοικίες Τσουκαλά, Λειβαδιώτη, μικρή και μεγάλη Ρούγα. Έξω από την Κύρια Πύλη (στην περιοχή της σημερινής οδού Ανεξαρτησίας) αναπτύσσεται η αγορά (εμπορίον - παζάρι). Στο κέντρο της αγοράς οικοδομήθηκε μεταξύ 1481-1512 το δεύτερο μεγάλο τέμενος, το Μπαραικλί τζαμί.

Μέσα στο 16ο αιώνα και μέχρι το 1611 η ανοικοδόμηση θρησκευτικών μουσουλμανικών κτηρίων είναι περιορισμένη. Την περίοδο αυτή ανεγείρονται εκτός της αγοράς τέσσερα μόνο ακόμη τζαμιά σχετικά αποκεντρωμένα (Σιεμ σε ντιν, Λιάμ τζαμί, Ναμάς Γκιαχ τζαμί, Ντεντέ Ουρούτσ).Ο 16ος αιώνας χαρακτηρίζεται από δημογραφική ανάπτυξη. Δύο τουρκικά κατάστιχα των ετών 1564 και 1579 παρέχουν σχετικές πληροφορίες. Ο πληθυσμός της πόλης έφθανε στους 7000 κατοίκους. Υπήρχαν τριαντα έξι συνοικίες χριστιανών εντός και εκτός του κάστρου και καταγεγραμμένα πενήντα οκτώ νοικοκυριά μουσουλμάνων και τριαντα τέσσερα εβραίων.

Την εποχή αυτή σημειώνεται ιδιαίτερη πνευματική ανάπτυξη. Στο Κάστρο λειτουργεί εκπαιδευτήριο και το νησί εξακολουθεί να αποτελεί μοναστικό και πνευματικό κέντρο. Ο Ιωασάφ Φιλανθρωπινός ανακαινίζει τη μονή Φιλανθρωπινών, η οποία κοσμείται με σημαντικές τοιχογραφίες στα 1542 και 1560. Την ίδια περίοδο τοιχογραφείται η μονή Στρατηγόπουλου και ιδρύεται η μονή Ελεούσας, καθώς και η μονή Προδρόμου από την φημισμένη οικογένεια των Αψαράδων. Σε σύγχρονη πηγή τα Γιάννινα ονομαζόταν «μοναχόπολις» λόγω των πολλών μοναχών, που ζούσαν στην πόλη και τη γύρω περιοχή.

Ο 17ος αιώνας στιγματίζεται από την αποτυχημένη εξέγερση του 1611 από τον επίσκοπο Τρίκκης και Σταγών Διονύσιο το Φιλόσοφο ή «Σκυλόσοφο». Το προνομιακό καθεστώς αίρεται, οι χριστιανικοί ναοί εντός και εκτός των τειχών καταστρέφονται και ακολουθούν διώξεις των χριστιανών, οι οποίοι εκδιώκονται από το κάστρο, όπου μένουν πια μόνο οι Τούρκοι. Από τους χριστιανούς καστρινούς, οι φτωχότεροι εγκαταστάθηκαν στις παραλίμνιες συνοικίες βυρσοδεψών, Σιαράβα και Λειβαδιώτη, ενώ οι ευπορότεροι στις βορειοδυτικές περιοχές και δημιουργήθηκαν ίσως οι συνοικίες Τσιγαρά, Πλάτανος, Σεράγι, Λιαμ μετζήτι, Αρχιμανδρειό.

Μετά το 1611 η πόλη κυριαρχείται από το μουσουλμανικό στοιχείο. Στο κάστρο ιδρύεται το 1618 το συγκρότημα του τζαμιού του Ασλάν Πασά στη βορειοανατολική ακρόπολη στη θέση του ανακτόρου του βυζαντινού διοικητή και τις υπόρειές της. Αρκετά τζαμιά οικοδομούνται και εκτός των τειχών (Μεχμέτ πασά, Ζεβαδιέ, Ισούφ αγά). Οι μουσουλμανικές συνοικίες έχουν ως κέντρο τους από ένα τζαμί, στο οποίο προσαρτώνται και κτήρια συνοδείας. Είναι η περίοδος της ολοκλήρωσης των Οθωμανικών κατακτήσεων. Ο αριθμός των μουσουλμάνων κατοίκων των Ιωαννίνων αυξάνεται, ενισχυόμενος από εξισλαμισμούς. Το 1635 καταργείται το δικαίωμα κατοχής φεουδαλικών ιδιοκτησιών από χριστιανούς και η χριστιανική αριστοκρατία αντιμετωπίζει το δίλημμα να χάσει την περιουσία της ή να αλλαξοπιστήσει. Έτσι σύμφωνα με τις πηγές, επάνω από τριακόσιες χριστιανικές οικογένειες άλλαξαν θρήσκευμα. Εκτός από την πληθυσμιακή αύξηση είναι εντυπωσιακή και η βελτίωση των οικονομικών συνθηκών του μουσουλμανικού στοιχείου, ένα είδος αστικοποίησης του, που οφείλεται κατά ένα ποσοστό στην ενασχόληση τους με το εμπόριο. Έτσι οι Μουσουλμάνοι τιμαριούχοι και οι πλούσιοι έμποροι αποτέλεσαν μία ακμάζουσα και μορφωμένη τάξη. Πολλοί από αυτούς προέβαιναν σε θρησκευτικές δωρεές (βακφιγιέ ) και πολλά αστικά κτήματα περνούσαν σε θρησκευτικά ιδρύματα.

Ο Εβλιγιά Τσελεμπή το 1670 περιγράφει εικόνα ευημερίας των Ιωαννίνων. Οι αρχές της πόλης έχουν έδρα τους το κάστρο, στο οποίο πλέον κατοικούν μόνο μουσουλμάνοι, χωρισμένοι σε τέσσερις συνοικίες. Η πόλη χωριζόταν σε τριανταεπτά συνοικίες, από τις οποίες δεκαοκτώ μουσουλμανικές, δεκατέσσερις χριστιανικές, τέσσερις εβραϊκές και μία τσιγγάνικη. Ο αριθμός των μουσουλμανικών ιδρυμάτων φθάνει τα επτά εντός του Κάστρου και τριανταεπτά έξω από αυτό. Περιλαμβάνουν τεμένη, σχολεία, αναγνωστήρια και υπαίθριους χώρους προσευχής. Παραδίδεται επίσης η ύπαρξη επτά μοναστηριών (τεκέ). Ο Εβλιγιά εκθειάζει την αρχιτεκτονική των σεραγιών, των αρχοντικών και απλών κατοικιών, αλλά και των τζαμιών, δημοσίων οικοδομημάτων (χάνια, χαμάμ κτλ). Επίσης περιγράφει μεγάλους ανοικτούς χώρους, όπως πλατείες, σταυροδρόμια με πηγάδια και εκτεταμένα νεκροταφεία. Στο τέλος του 17ου αιώνα η πόλη εκτεινόταν από την Καλούτσιανη έως το Σαράι μαχαλέ και από το Κάστρο έως τη Λούτσα.